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PCR實驗代測的模板濃度

更新時間:2024-01-02      瀏覽次數:496

PCR實驗代測的模板濃度


 服務內容:


1.制定個性化實驗方案:根據不同的實驗目的確定實驗方案、選定合適的內參;


2.檢測類別:mRNA、miRNA、lncRNA、DNA;


3.樣本抽提及質檢:對客戶提供樣本進行RNA抽提,并利用NanoDrop進行樣本質檢;


4.定量PCR預實驗:包括樣本反轉錄為CDNA、配置PCR反應體系及進行Real-TimePCR反應;


5.正式定量PCR實驗:根據預實驗結果進行正式實驗;


6.數據分析:采用2- △△CT法進行分析,比較不同樣本間差異。


影響Ct值的關鍵因素


模板濃度


模板濃度是決定Ct的最主要因素。控制在一個合適范圍內,使Ct在15-35之間


反應液成分的影響


任何分子的熒光發射都受環境因素影響----比如溶液的pH值和鹽濃度。


PCR反應的效率


PCR反應的效率也會影響Ct值。在PCR擴增效率低的條件下進行連續梯度稀釋擴增,與PCR擴增效率高的條件下相比,可能會所產生斜率不同的標準曲線。PCR效率取決于實驗、反應混合液性能和樣品質量。一般說來,反應效率在90-110%之間都是可以接受的。


Real-time qPCR常見參數


基線(baseline)通常是3-15個循環的熒光信號


同一次反應中針對不同的基因需單獨設置基線


閾值(threshold)


自動設置是3-15個循環的熒光信號的標準偏差的10倍


手動設置:置于指數擴增期,剛好可以清楚地看到熒光信號明顯增強


同一次反應中針對不同的基因可單獨設置閾值,但對于同一個基因擴增一定要用同一個閾值。


Ct值:與起始濃度的對數成線性關系。


分析定量時候一般取Ct:15-35。太大或者太小都會導致定量的不準確。


Rn(Normalized reporter)是熒光報告基團的熒光發射強度與參比染料的熒光發射強度的比值。


△Rn:△Rn是Rn扣除基線后得到的標準化結果(△Rn=Rn-基線)。


如何評估實時定量PCR反應的效果


PCR擴增效率:為了正確地評估PCR擴增效率,至少需要做3次平行重復,至少做5個數量級倍數(5logs)連續梯度稀釋模板濃度。


另一個評估PCR效率的關鍵參數是相關系數R2,它是說明兩個數值之間相關程度的統計學術語。如果R2等于1,那么你可以用Y值(Ct)來準確預測X值(量)。如果R2等于0,你就不能通過Y值來預測X值。R2值大于0.99 時,兩個數值之間相關的可信度很好。


PCR實驗代測的模板濃度


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