miRNA QPCR檢測(cè)

服務(wù)介紹：

熒光定量PCR是通過(guò)熒光染料(SYBR Green)或熒光標(biāo)記的特異性的探針，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記跟蹤，實(shí)時(shí)在線監(jiān)控反應(yīng)過(guò)程，結(jié)合相應(yīng)的軟件可以對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行分析，計(jì)算待測(cè)樣品模板的初始濃度。可以用于檢測(cè)miRNA的基因表達(dá)水平。

　實(shí)驗(yàn)流程：

取材-RNA提取逆轉(zhuǎn)錄成cDNA-miRNA引物設(shè)計(jì)合成-QPCR擴(kuò)增-數(shù)據(jù)分析-發(fā)報(bào)告

miRNA采取特異性逆轉(zhuǎn)錄，默認(rèn)采用莖環(huán)法，如需使用加尾法請(qǐng)?zhí)崆案嬷?/p>

送樣運(yùn)輸要求：

1. 樣品處理

a) 動(dòng)物組織：常規(guī)組織100mg，脂肪組織，結(jié)締組織，纖維化組織適當(dāng)增加。將組-織剪切成合適大小后（建議組織塊長(zhǎng)寬高均不大于0.5 cm），然后迅速完-全浸泡于5～10倍體積的RNAsolidTM試劑中。（注意：已浸入RNAsolidTM試劑中的組織經(jīng)平衡一段時(shí)間后，可從溶液中取出，切成更小的組織塊，再重新放回RNAsolidTM試劑中；有些比較弱的液體滲透性組織如骨頭等，不適合用RNAsolidTM試劑進(jìn)行RNA保護(hù)。）

b) 植物組織：新鮮的葉、果肉、種子等最少100 mg。將嫩葉，嫩莖組織切成合適的大小（建議長(zhǎng)寬高均不大于0.5 cm）后，然后迅速完-全浸泡于5～10倍體積的RNAsolidTM試劑中。（注意：某些植物組織天生具有的屏障，如葉子表面的蠟層可阻礙RNAsolidTM試劑的滲透，對(duì)于此類組織，通常需破壞這些屏障層以允許溶液的浸透。）

c) 細(xì)胞等樣本：收集不少于10^6個(gè)細(xì)胞沉淀（用PBS清洗1-2次），干冰運(yùn)輸。

d) 酵母、細(xì)菌等樣本：離心棄上清，收集一定量的菌體沉淀，干冰運(yùn)輸。

e)全血：最少1 mL新鮮血液EDTA抗凝管，干冰運(yùn)輸。

f)血清或血漿：最少1 mL，干冰運(yùn)輸。

g) RNA樣品： OD260/280為1.8-2.0，濃度≥100 ng/μL，體積≥20μL，干冰運(yùn)輸。

h)cDNA（必須能檢測(cè)miRNA基因）：cDNA原液≥20 μL，干冰運(yùn)輸。 

2. 樣品保存及運(yùn)輸

加入有RNAsolidTM試劑的樣本可在37℃保存1～2天，2天以后部分組織中的RNA會(huì)開(kāi)始降解。室溫（25℃）穩(wěn)定保存1周，不會(huì)有明顯的RNA降解發(fā)生。大部分樣品置于RNAsolidTM試劑中，4℃條件下可穩(wěn)定保存1個(gè)月，不會(huì)有明顯的RNA降解發(fā)生。長(zhǎng)期存放可先將保存在RNAsolidTM試劑中的樣本4℃浸透過(guò)夜，然后將RNAsolidTM試劑吸出棄去，再將樣本放入-20℃或-80℃長(zhǎng)期穩(wěn)定保存3～5年。